越来越多的客户在购买杂质对照品时需要含量值,而针对于杂质对照品来说,由于杂质通常产量很低且价格贵,无法进行复杂的标定或标定成本太高,在申报中,COA报告中含量值尽可能接近于真值即可,最常见的性价比最高的两种含量值分别是TGA(热重分析)及QNMR(定量核磁)
TGA
首先我们介绍最常见的TGA(热重分析),TGA通常只需要消耗3-5mg样品即可,那么什么是TGA呢?
热重分析法(TGA)是在规定程序控制变化的温度范围内,测量被分析样品的重量相关量(如质量、固体残留量或残留率等)随温度或时间的变化关系。
通过分析热重曲线,我们可以知道样品的热稳定性、热分解情况及其杂质组成、热分解产物等与质量相联系的信息。热重量分析的主要特点是普适性高、样品消耗少、灵敏、能准确地测量物质的质量变化及变化的速率。可以说,只要物质受热时会有组分逸出而引发质量的变化,都可以用热重量分析来研究。
下面我们H&D厂家(www.hdimpurity.com)提供的TGA报告为例,简单介绍一下如何解读TGA数据呢。
从图中可以看出,厂家采用耐驰的TGA设备TG209F1,对某一药物杂质对照品进行检测,采用的是氮气氛围,升温范围30~800 °C。30-110 °C区间,产品的质量减失百分比1.14%;110-400 °C之间的质量减失百分比大于99%;400-600 °C之间的质量减失百分比很少,趋于平衡;最终800 °C下残碳量为0.35%。
数据上看是某个温度区间的产品质量变化,但是这些数据代表的含义是什么,不妨我们一起来探讨探讨:
阶段一:30-105摄氏度,产品的质量减失百分比1.14%,失重曲线平缓,主要源于吸附水逸出。一般认为,在100~120 °C左右失去结晶水和结合水。若样品中含有较多的低沸溶剂残留,则有可能观察到一个明显的失重峰。而这张图中没有明显的失重峰,说明溶残不多或者残留溶剂的挥发性与水接近。
阶段二:110-400 °C之间的质量减失百分比大于99%,失重曲线前段平缓,在300 °C左右开始骤变,这说明样品开始热降解。大多数有机物在250-300度即开始氧化分解。
阶段三:400-600 °C之间的质量减失百分比很少,此段产品的热分解基本完成,质量逐渐趋于稳定。
阶段四:800°C残碳量为0.35%,此值不可完全等价与灰分。由于采用的是氮气氛围,剩下的残渣里面有炭残留,如果是采用空气氛围,那我们才可以理解为灰分,此两者是有区别的。一般来说,杂质标定需要测:色谱纯度、干燥失重、炽灼残渣。但由于样品量少,时常有人以此项代替炽灼残渣,应注意其差异。
此外还有厂家仅使用TGA表征水分、溶残和残渣,即测试在105摄氏度的减失质量百分比作为水分和溶残总和,然后测定800 °C的残留量作为灰分数据,最终折算出含量。这样做虽然简便,但缺少其他测试数据作为佐证,存在一定的风险。
QNMR
定量核磁同样作为确定该杂质对照品含量的一种常用方法,严格来说需要测多次取平均值,但受限于杂质对照品样品量及成本问题,大部分客户采用单针或双针平均值作为含量值,我们简单介绍下定量核磁(QNMR)的基本原理
(一)特点:1、对于确定的核(质子),其信号强度与产生该信号的核(质子)的数目成正比,而与核的化学性质无关。2、利用内标法或相对比较法,分析混合物中某一化合物时可无需该化合物的纯品作对照。3、信号峰的宽度很窄,远小于各信号之间的化学位移的差值,因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。4、方法简易快速、专属性高,可选择性地测定复方药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体;一般无需分离,且不破坏被测样品。
(二)定量分析方法:NMR图谱中,可获得化学位移、偶合常数、共振峰面积或峰高。化学位移和偶合常数是结构测定的重要参数;而共振峰面积或峰高是定量分析的依据。共振峰面积或峰高直接与被测组分的含量成正比。定量分析时,一般只对该化合物中某一指定基团上质子引起的峰面积或峰高与参比标准中某一指定基团上质子引起的峰面积进行比较,即可求出其绝对含量。当分析混合物时,也可采用其各个组分的各自指定基团上质子产生的吸收峰强度进行相对比较,然后求得相对含量。因此,在测量峰面积或峰高以前,必须了解化合物的各组成基团上质子所产生共振峰的相应位置,也就是它们的化学位移值(d值),并选择一个合适的峰作为分析测量峰。常用的NMR定量分析方法有:
1、内标法(绝对测量法):在样品溶液中,直接加入一定量内标物质后,进行NMR光谱测定。将样品指定基团上的质子引起的共振峰(即吸收峰)面积与由内标物质指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较,当样品与内标均经精密称重时,则样品的绝对重量(Wu)可由下式求得:Wu/Ws=Au·EWu/ As·EWs —— Wu=Ws·Au·EWu/ As·EWs 式中:Au为样品测得和峰面积(不少于5次测定的平均值);As为内标物测得的峰面积(不少于5次测定的平均值);EWu为样品在该化学位移处的质子当量;EWs为内标在该化学位移处的质子当量。若样品重为W,则百分含量=Wu/W ×100%
对内标物要求:(1)最好能产生单一的共振峰,在扫描的磁场区域中,参比共振峰与样品峰的位置至少有30Hz的间隔;(2)应溶于分析溶剂中;(3)应有尽可能小的质子当量(EWs);(4)不应与样品中任何组分相互作用。常用的内标物有:苯或苯甲酸苄酯(在5.3ppm处,由C6H5COOCH2-C6H5中的-CH2所致),适用于非芳香化合物;马来酸,适用于非链烯型化合物。
2、相对测量法:当不能获得样品的纯品或合适的内标时,可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。计算相对含量是以样品指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A1/n1)和杂质指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A2/n2)进行比较,然后按下式计算样品与该杂质的相对百分含量:
样品的相对百分含量={(A1/n1/[(A1/n1)+(A2/n2)]}×100%
式中,n1和n2是指定基团的质子数。本法适用于含有一、二种杂质的样品的分析。
3、外标法:欲测样品中某一组分的含量,可采用该组分的标准品做成一系列不同浓度的标准液,使样品液浓度在其范围内,然后进行NMR测定,由所得图谱中某一指定基团上质子引起的峰面积对浓度作图,即得标准品的校正曲线。在平行条件下,测定样品溶液组分指定基团上质子的峰面积,即可由校正曲线求得样品的浓度。
4、峰高或峰位测量法:结构相似的混合物样品(如互为异构体),由于其NMR峰分离效果不好,用峰面积定量法不能精确测定,误差较大,此时可考虑采用峰高测量法或峰位测量法。(1)峰高测量法:是基于峰高与样品中有关核的浓度成正比,各组分之间的峰高比只取决于样品的百分组成,而与样品的多少和仪器的性能无关。测定某一对异构体时,先用异构体I和II的纯品配成溶液,再用质子快速交换简化光谱。由简化的NMR光谱可知两异构体的吸收峰互不干扰;可测出各自峰高。两者摩尔数MI+MII=1,若两者的峰高为HI和HII,则:HI=MI×CI=(1-MII)CI ;HII=MII×CII ;两式中,CI和CII是异构体I和II的峰高系数,为已知,HI和HII可测得。据此可求得MI和MII。 (2)峰位测量法:当样品中两种组分之间具有可进行质子快速交换的基团时,经质子快速交换后,原来两种组分基团的信号合并,在NMR光谱上得到单一信号,此峰的化学位移与两组分的摩尔分数有线性关系,因此,测出混合物的化学位移,可直接求出二组分的混合比例。如有机胺及其盐的N-CHa上的质子可以进行质子快速交换,可用NMR法定量测定有机胺酸性水溶液的氯仿提取液中游离胺及其盐的比例。混合物中N-CHa的化学位移(dm)可按下式计算:dm=db+(da-db)Xa 式中db和da为纯的游离胺及其盐的化学位移,Xa为盐的摩尔分数。以dm对Xa或Xb(游离胺的摩尔分数)作图,应呈直线关系。因此可先用纯品配成已知组成比例的混合物,测得其dm并作出校正曲线后,再测得未知混合物的dm,即可由校正曲线求得Xa或Xb。
附H&D定量核磁报告参考:
Analytical Report
Test Item:QNMR
Instrument:Bruker Avance Ⅲ 400MHz
Sample ID:S007002-20181001
CAS: N/A MW:389.32
Compound ID:N/A
Internal Standard(ISTD):Maleic Acid MW:116.07
Solvent:DMSO-d6
The chemical shiftfor quantitative of sample: 7.15-7.29 nSam=3
The chemical shift for quantitative of standard:6.15 nISTD=2
Results:
NO. | WSam(mg) | WISTD(mg) | ASam/AISTD | WISTD% | W% | Averrage(W%) | RSD(%) |
1 | 7.882 | 4.438 | 0.7686 | 98.8 | 95.61 | 95.77 | 0.23 |
2 | 7.907 | 4.503 | 0.7624 | 95.92 |
Note:The Result of RSD should be less than or equle to 2.0%
Formula of calculationl:
Among the formula:
WISTD:The weight of ISTD(mg);
WSam:The weight of sample(mg);
ASam/AISTD:The integral area ratio between sample and ISTD;
MWSam:The molecular weight of sample;
MWISTD:The molecular weight of ISTD;
nSam and nISTD:The number of protons in the respective functional groups;
WISTD%:The purity of ISTD;
W%:The purity of sample.
Appendix 1: Q-NMR
Appendix 2: Q-NMR